Protective effect of normothermic mechanical perfusion with red blood cells from humanized genetically modified pigs on severed human limb
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摘要:目的
探讨人源化基因修饰猪血红细胞常温机械灌注对人离断肢体的保存作用。
方法采用人源化基因修饰猪血红细胞灌注人离断肢体6 h。每小时取灌注液检测血氧分压、Na+、K+、Ca2+、pH值、葡萄糖、乳酸及肌酸激酶水平，取浅层屈肌检测肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-2、IL-1变化。灌注0 h、6 h取适量前臂浅层屈肌，进行病理学检查，观察骨骼肌细胞间隙及糖原消耗情况。每2 h取适量前臂血管，检测血管内皮细胞凋亡情况。灌注开始前及灌注6 h行X线造影，观察指端末梢血管充盈度。
结果灌注过程中氧分压处于正常范围。Na+在1 h出现高峰，达到138.7 mmol/L，之后波动于正常范围；K+在2 h出现高峰，为6.08 mmol/L，之后下降，波动于正常范围；Ca2+在4 h达高峰，为1.03 mmol/L。葡萄糖在灌注开始时逐渐降低，灌注2 h时达最低值17.7 mmol/L，之后维持动态平衡。pH值在灌注6 h降低为7.28，乳酸水平在灌注1 h时升高，达到9.6 mmol/L，之后逐渐呈下降趋势。肌酸激酶水平从灌注开始升高，于2 h到达高峰，为20 030 U/L，之后下降，在灌注结束时保持稳定。灌注结束肌纤维形态正常，肌纤维间隙略有增大，骨骼肌糖原未见明显蓄积。灌注0 h时血管内皮凋亡细胞数量较多，6 h时凋亡细胞数量减少。灌注0 h时血管充盈明显，6 h时指间部分血管充盈程度减低。
结论人源化基因修饰猪血红细胞常温机械灌注人断肢能持续稳定的供能供氧，保持灌注液离子酸碱度平衡，维持细胞正常代谢，对离断肢体有一定保护作用。
Abstract:ObjectiveTo evaluate the preservation effect of normothermic mechanical perfusion with red blood cells from humanized genetically modified pig on severed human limbs.
MethodsSevered human limbs were perfused with red blood cells from humanized genetically modified pigs for 6 h. Perfusion solution was taken every hour to measure the oxygen partial pressure, Na+, K+, Ca2+, pH value, glucose, lactic acid and creatine kinase levels. Superficial flexor muscle was sampled to detect the changes of tumor necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-2 and IL-1 levels. At 0 and 6 h after perfusion, the superficial flexor muscles of the forearm were taken for pathological examination. Intercellular space and glycogen consumption of skeletal muscles were observed. An appropriate amount of forearm vessels was collected every 2 h to detect the apoptosis of vascular endothelial cells. X-ray angiography was performed before perfusion and 6 h after perfusion to observe the filling degree of finger-tip peripheral vessels.
ResultsThe oxygen partial pressure was observed in the normal range throughout the perfusion. Na+ concentration peaked at 1 h, reaching 138.7 mmol/L, and then fluctuated within the normal range. K+ level peaked at 2 h up to 6.08 mmol/L, then decreased and fluctuated within the normal range. Ca2+ concentration reached the peak at 4 h, up to 1.03 mmol/L. Glucose level was gradually decreased at the beginning of perfusion, reaching the lowest value of 17.7 mmol/L at 2 h after perfusion, and then maintained a dynamic balance. The pH value was decreased to 7.28 at 6 h after perfusion. The lactic acid level was increased to 9.6 mmol/L at 1 h after perfusion, and then gradually decreased. The creatine kinase level was increased at the start of perfusion, reached the peak at 2 h up to 20 030 U/L, then decreased and remained stable at the end of perfusion. At the end of perfusion, the morphology of muscle fibers was normal, the gap among muscle fibers was expanded slightly, and the glycogen of skeletal muscles was not significantly accumulated. At 0 h perfusion, the number of apoptotic cells in vascular endothelial cells was large, which was declined at 6 h perfusion. Evident vascular filling was observed at 0 h, and the filling degree of some finger-tip vessels was decreased at 6 h.
ConclusionsNormothermic mechanical perfusion of severed human limbs with red blood cells from humanized genetically modified pigs may continuously and stably supply energy and oxygen, adjust the ion pH balance of perfusion solution, maintain normal cellular metabolism and exerts certain protective effect upon severed human limbs.
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严重创伤引起肢体离断、血流终止，离断肢体缺血、缺氧产生的有害分子引起级联反应最终导致死亡。目前研究认为机体缺血后细胞发生酸中毒及水肿，进而引起细胞膜和细胞器的继发性损伤，造成细胞死亡，同时与自由基的产生、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）耗竭、离子稳态失衡有关[1]。当发生肢体离断或毁损伤时，目前对离断肢体保存的金标准仍是静态冷保存（static cold storage，SCS），但其对离断肢体的保存时间有限，离断肢体在静态冷保存条件为4~6 h，超过6 h会对肢体造成不可逆损伤 [2-3]。
体外机械灌注技术联合氧合膜肺，可以替代心肺功能将血液输送到组织同时提供氧气和能量，在肝、心、肾、肢体和肺组织移植前的保存和术后功能恢复有重要作用[4-8]。与SCS不同，机械灌注是从器官固有血管系统插管，连续灌注输送养分，同时对器官进行保存与修复[5]。常温机械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）作为机械灌注方式的一种，因其接近人体生理环境（32~37 ℃），在肾脏、肝脏、心脏以及小肠移植等方面已有应用且可使相应器官的功能恢复[9-13]。NMP有可能补充和维持ATP水平，从而减轻缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）[14]，且其温度接近生理条件，使器官在移植前保存生存能力和质量评估成为可能[6]。国内外相关研究表明，离断肢体借助机械灌注维持24 h，组织损伤仍低于SCS 4~6 h[15-18]。
NMP采用血液灌注，更符合生理条件，保存效果更好，但由于血液紧缺，且存在配型不合，运输困难和传染病等问题，获得困难和应用受限[19]。异种血是良好的选择，基因修饰猪饲养周期短，可大量获得血红细胞，解决血液短缺问题，更易在低温下保存和远距离运输。近年来，随着基因修饰技术的发展，排斥反应、凝血功能失调，炎症反应以及猪逆转录病毒等问题有望得到解决[20-24]。据此，本研究设计一种人源化基因修饰猪红细胞联合便携式机械灌注装置在常温下灌注离断肢体的模型，探索NMP对离断肢体的保存作用，为肢体的保存提供参考。
1. 材料与方法
1.1 动物及断肢来源
转基因猪由成都中科奥格生物科技有限公司提供，敲除α-1, 3-半乳糖基转移酶（α-1, 3-galactosyltransferase，GGTA1 ）基因、 β-1,4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶2 （ β-1, 4-N-acetylgalactosaminyltransferase 2，β4GalNT2）基因、单磷酸胞嘧啶-N-乙酰神经氨酸羟化酶（cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH）基因，转入人补体调节蛋白（hCD46、hCD55）和人血栓调节蛋白（human thrombomodulin，hTBM），即GTKO/β4GalNT2KO/CMAHKO/hCD55/hCD46/hTBM的六基因修饰猪，本实验经中国人民解放军军事医学研究院生物医学伦理委员会批准（审批号：IACUC-DWZX-2021-503）。
断肢来源于1例68岁女性患者，于2023年8月因右上肢肱骨近端淋巴管肉瘤于解放军总医院第四医学中心行右上肢经肱盂关节离断术。本研究经解放军总医院临床伦理委员会审批通过（审批号：S2021-685-01）。
1.2 主要试剂与仪器
主要试剂包括4%多聚甲醛、0.9%氯化钠溶液，葡萄糖酸钙、盐酸赛拉嗪、盐酸替来他明、盐酸唑拉西泮、肝素钠、羟乙基淀粉130/0.4氯化钠、头孢唑林钠、甲泼尼龙琥珀酸钠、葡萄糖、胰岛素、碳酸氢钠注射液，苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）、过碘酸-雪夫（periodic acid-Schiff，PAS）染色液，脱氧核糖核酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒，人肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白细胞介素（interleukin，IL）-2、IL-1酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immune absorbent assay，ELISA）试剂盒，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）。
主要仪器包括荧光显微镜、冷冻切片机、膜式氧合器、蠕动泵、恒温箱、制氧机、储物槽、全自动血生化分析仪、血细胞分析仪、离心机。
1.3 实验方法
血液收集：在猪右侧臀部分别注射0.03 mL/kg的盐酸赛拉嗪和盐酸唑拉西泮。备皮、消毒后仰卧于手术台上，铺无菌巾单，沿右侧颈部切开一小口置入10F引流管，结扎固定，外接无菌血袋，储存于4 ℃冰箱。
灌注液配备：从4 ℃冰箱中取出采集好的血液，将400 mL羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液加入至400 mL血液中，依次加入葡萄糖酸钙注射液20 mL、头孢唑啉钠注射液1 g、甲泼尼龙琥珀酸钠注射液500 mg、肝素钠注射液12 500 U、葡萄糖注射液10 mL、胰岛素注射液1 U、碳酸氢钠注射液10 mL，根据灌注液检测数值进行调整。
灌注装置包括膜式氧合器、蠕动泵、恒温箱、制氧机、储物槽、连接管（内径6.44 mm，外径9.6 mm）。灌注过程中，每2 h取少量前臂浅层屈肌，分别在多聚甲醛中固定和Ep管中深低温冰箱保存。
1.4 研究内容及方法
1.4.1 血氧分压检测
自灌注开始，每小时抽取灌注液进行血气分析，记录动脉血氧分压。
1.4.2 离子和酸碱度检测
每小时收集灌注液，检测Na+、K+、Ca2+、葡萄糖水平、pH值、乳酸水平，分析离断肢体的细胞代谢和酸碱平衡。
1.4.3 肌酸激酶水平
每小时收集灌注液2 mL，放置乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）管中离心后留取血清检测。
1.4.4 组织炎症因子变化
取灌注0 h、2 h、4 h、6 h肌肉组织，按照ELISA试剂盒说明书，检测TNF-α、IL-2、IL-1水平。
1.4.5 组织病理学
取灌注0 h、6 h肌肉组织，制备石蜡切片行HE染色，观察骨骼肌形态和肌间隙变化。行PAS染色观察肌肉组织中葡萄糖的消耗。
1.4.6 血管细胞凋亡检测
留取每2 h血管，使用TUNEL染色检测细胞凋亡情况。
1.4.7 X线造影观察末梢血管充盈度
实验前后拍摄离断肢体的正斜位片。灌注0 h、6 h拍摄X线片（电压：90 KV，电流：4 mA），并从肱动脉置管处注入15 mL碘海醇造影剂进行对比，观察末梢血管的充盈程度。
1.5 统计学方法
采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，两组间的比较采用独立样本t检验。所有检验为双侧，P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结 果
2.1 灌注过程中动脉血氧分压及肌酸激酶变化
灌注期间氧分压波动于304.95～318.21 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），肢体含氧量较高，未见肢体缺氧，血氧分压波动较大（图1A）；肌酸激酶水平为3 538~20 030 U/L（图1B）。
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图 1 灌注过程中氧分压及肌酸激酶变化注：A图为氧分压变化；B图为肌酸激酶变化。Figure 1. Changes in oxygen partial pressure and creatine kinase during perfusion2.2 灌注过程中细胞代谢和组织炎症因子变化
灌注液Na+水平为136.6~138.7 mmol/L，K+水平为4.46~6.08 mmol/L，Ca2+水平为0.25~1.03 mmol/L，葡萄糖水平为17.7~59.0 mmol/L，pH值为7.28~7.48，乳酸水平为4.60~9.62 mmol/L（图2A~F）。
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图 2 灌注过程中细胞代谢和组织炎症因子变化注：A图为Na+水平变化；B图为K+水平变化；C图为Ca2+水平变化；D图为葡萄糖水平变化；E图为pH值变化；F图为乳酸水平变化；G图为TNF-α水平变化；H图为IL-2水平变化；I图为IL-1水平变化。Figure 2. Changes in cellular metabolism and inflammatory factors in tissues during perfusion灌注过程中，肌肉组织TNF-α水平相对稳定，IL-2水平略微波动，IL-1水平总体呈下降趋势（图2G~I）。
2.3 灌注前后组织病理学表现
HE染色结果显示，灌注0 h骨骼肌纤维排列致密，肌间隙正常；6 h肌纤维排列仍较致密，失去部分组织形态，肌间隙未见明显增大（图3A~B）。
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图 3 灌注开始及结束时骨骼肌病理表现及糖原水平注：A图为灌注0 h断肢前臂浅层屈肌（HE，×200）；B图灌注6 h断肢前臂浅层屈肌（HE，×200）；C图为灌注0 h糖原表达（PAS，×200）；D图为灌注6 h糖原表达（PAS，×200）；E图为灌注0 h、6 h骨骼肌细胞内糖原面积比较。Figure 3. Skeletal muscle pathological manifestations and glycogen content at the beginning and end of perfusionPAS染色显示，灌注0 h肌肉组织糖原水平正常；6 h肌糖原消耗，未见明显蓄积（图3C~E）。
2.4 灌注过程中血管细胞凋亡情况
TUNEL染色结果显示，灌注0 h时凋亡细胞数量较多，2 h、4 h时凋亡细胞数量无明显变化，6 h时凋亡细胞数量减少（图4）。
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图 4 灌注过程中血管细胞凋亡情况（TUNEL，×500）注：A图为灌注0 h血管细胞凋亡情况；B图为灌注2 h血管细胞凋亡情况；C图为灌注4 h血管细胞凋亡情况；D图为灌注6 h血管细胞凋亡情况。Figure 4. Apoptosis of vascular cell during perfusion2.5 灌注前后末梢血管充盈程度
灌注0 h可见末梢指间动脉显影明显，其增强图像更能明显看到充盈的指间动脉。6 h末梢血管的充盈程度较0 h部分充盈程度减弱，增强图像表现出相同的征象（图5）。
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图 5 灌注前后末梢血管X线摄影注：A图为灌注0 h经肱动脉碘海醇增强造影，指间动脉显影明显；B图为灌注0 h经肱动脉碘海醇造影，指间动脉可见明显充盈；C图为灌注6 h经肱动脉碘海醇增强造影，指间动脉部分显影；D图为灌注6 h经肱动脉碘海醇造影，指间动脉可见充盈不明显。Figure 5. Peripheral vascular X-ray imaging before and after perfusion3. 讨 论
肢体离断后的再灌注对于离断肢体组织的保护有显著的临床意义，目前国内外对四肢离断的保存尚无明确结论。肢体由来源于不同胚层的细胞发育而来，骨骼肌对IRI最为敏感[25-26]。本研究发现NMP可通过供能供氧、平衡离子稳态、减少炎症因子产生、减少乳酸产生等保护骨骼肌细胞，减轻IRI。
NMP采用氧合的方法能减轻离断肢体再灌注后的氧化损伤[27-28]。美国耶鲁大学团队表明，蠕动泵会破坏红细胞，6 h后对组织的保护作用明显降低[29]。本研究中，人源化转基因猪血红细胞为骨骼肌细胞提供持续的氧气供给，在整个灌注期间，肢体含氧量较高，未见肢体缺氧。Na+、K+和Ca2+主要维持细胞渗透压和细胞电活动，本研究中Na+水平未见明显波动，可以维持正常的机体Na+-K+泵交换，K+水平在灌注2 h时达最高，6 h略有升高，可能因为灌注过程中蠕动泵造成红细胞机械性损伤使细胞内大量K+释放到细胞外，以及骨骼肌细胞凋亡，坏死膜内K+释放。Ca2+水平4 h内缓慢升高，一定程度上是由于向灌注液中添加葡萄糖酸钙所致，以及Na+-Ca2+交换增多引起。
肌酸激酶水平在3 h内升高可能是由于蠕动泵灌注对红细胞造成机械性损伤，导致溶血。缺氧时机体进行无氧糖酵解，引起ATP耗尽，ATP产生障碍，Na+-Ca2+泵停止转运，细胞内环境稳态丧失，诱导炎症因子表达和组织水肿[30-32]。灌注过程中葡萄糖的水平在2 h内出现明显下降，可能是由于骨骼肌耗能增多，葡萄糖开始供能，2 h后温度平稳，葡萄糖耗能基本维持平衡状态。葡萄糖水平过高可能受外部添加的影响。pH值从1 h后开始略有下降，可能是由于H+-K+交换增多引起。灌注开始到灌注结束，糖原水平出现明显下降，是葡萄糖供能的表现。乳酸水平在灌注过程中未见明显增加，与葡萄糖有氧供能有一定关系。
Said等[33]对血红蛋白类氧载体进行了研究，证明其免疫原性低、无溶血反应危险、扩散氧传递等优点。但是人工合成血红蛋白生产成本高，产量和纯度过低，不能满足大规模生产需求，需探索新的合成体系[34]。另外由于其没有完整的细胞结构，释氧速率快于天然红细胞[35]。猪红细胞的计数、直径、体积、渗透压和平均寿命等生理参数都与人类十分接近，且猪血红蛋白与人血红蛋白也具有相似的三维结构，存在85%基因相似度。本研究选用的基因修饰猪转入了人血栓调节蛋白，具有抗炎、抗凝等功能[36-37]。灌注结束后灌注液中可见TNF-α随着灌注时间的延长呈现相对稳定的变化，IL-2在灌注过程中略微波动，IL-1随着灌注时间的延长呈下降趋势，总体呈现出炎症反应减轻。NMP在骨骼肌组织保存方面可以较好维持血氧分压、离子稳态、葡萄糖供应和炎症因子水平，能够较好的维持骨骼肌细胞的形态和功能，有可能成为替代SCS的方法[38]。
当血流中断，短时间内膜去极化、细胞水肿、血管通透性增加，最终导致细胞坏死[4]。组织水肿可能通过纠正离子失衡和酸碱度来调节。本研究中，人源化基因修饰猪血红细胞用于灌注6 h未发现明显细胞凋亡，表明NMP可能为离断肢体提供ATP，减缓细胞凋亡。灌注0 h时离断肢体末端血管造影显示微循环血管充盈，6 h时末端血管造影显示微循环充盈程度差，可能是由于灌注过程中离断肢体水肿，微循环动脉阻力增加引起。
综上所述，本研究发现人源化基因修饰猪血红细胞用于NMP能持续稳定地对断肢供能供氧、保持离子稳态和调节酸碱度，减少炎症因子产生，在骨骼肌细胞保存方面有效，可为离断肢体缺血性损伤的保存开拓新的路径，为将来临床前试验提供参考。但本研究缺少免疫原性评价，未来还需从蛋白质和基因层面对通路和机制进行研究，以及从线粒体等细胞器方面进行评价。
致谢：感谢解放军总医院第四医学中心为本研究提供离断肢体！
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图 1 灌注过程中氧分压及肌酸激酶变化
注：A图为氧分压变化；B图为肌酸激酶变化。
Figure 1. Changes in oxygen partial pressure and creatine kinase during perfusion
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图 2 灌注过程中细胞代谢和组织炎症因子变化
注：A图为Na+水平变化；B图为K+水平变化；C图为Ca2+水平变化；D图为葡萄糖水平变化；E图为pH值变化；F图为乳酸水平变化；G图为TNF-α水平变化；H图为IL-2水平变化；I图为IL-1水平变化。
Figure 2. Changes in cellular metabolism and inflammatory factors in tissues during perfusion
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图 3 灌注开始及结束时骨骼肌病理表现及糖原水平
注：A图为灌注0 h断肢前臂浅层屈肌（HE，×200）；B图灌注6 h断肢前臂浅层屈肌（HE，×200）；C图为灌注0 h糖原表达（PAS，×200）；D图为灌注6 h糖原表达（PAS，×200）；E图为灌注0 h、6 h骨骼肌细胞内糖原面积比较。
Figure 3. Skeletal muscle pathological manifestations and glycogen content at the beginning and end of perfusion
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图 4 灌注过程中血管细胞凋亡情况（TUNEL，×500）
注：A图为灌注0 h血管细胞凋亡情况；B图为灌注2 h血管细胞凋亡情况；C图为灌注4 h血管细胞凋亡情况；D图为灌注6 h血管细胞凋亡情况。
Figure 4. Apoptosis of vascular cell during perfusion
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