在过去的40多年，心脏移植在治疗终末期心脏疾病方面取得了重大的成功。然而，移植术后排斥反应仍然是影响移植效果的主要因素^[1-2]。随着免疫抑制剂的发展，细胞介导的排斥反应（cell-mediated rejection，CMR）已经得到很好的控制；然而，抗体介导的排斥反应（antibody-mediated rejection，AMR）发生率仍较高，是目前导致移植物失功的重要因素^[3-6]。

疾病的基础研究依赖动物模型，目前对于心脏移植排斥反应动物模型的建立方法主要为利用不同品系的小鼠进行心脏移植，该模型在移植早期主要表现为CMR，利用药物干预后随着存活时间的延长会出现AMR和慢性排斥反应^[7-11]。对于心脏移植急性AMR动物模型的建立研究较少，本课题组前期的研究利用不同品系的大鼠在皮肤移植后行心脏移植，建立了大鼠心脏移植AMR模型并连续分析了其特点^[12]，但是小鼠心脏移植急性AMR的模型笔者未见报道。我们在小鼠AMR模型的建立方面有丰富的经验，前期利用不同品系间小鼠皮肤移植预致敏后行肾移植建立了小鼠肾移植AMR模型，并利用该模型进行了一系列研究^[13-15]。本研究中，我们利用不同品系间小鼠皮肤移植后行心脏移植，旨在建立小鼠心脏移植急性AMR模型并进行分析。

1.   材料与方法

1.1   实验动物、主要试剂与手术设备

雄性Balb/c（H-2d）小鼠27只，雄性C57BL/6（H-2b）小鼠45只，6~8周龄，体质量20~25 g，均为无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于华南农业大学实验动物中心SPF级小鼠室。

主要试剂包括环孢素注射液（瑞士诺华制药有限公司），山羊抗小鼠IgG抗体、CD3抗体（英国Abcam公司），山羊抗小鼠IgM抗体（Jackson免疫研究实验室，115-297-020），C4d抗体（荷兰Hycult Biotech公司）。

手术设备主要包括连续变焦双面体视手术显微镜（型号TS-39NK，镜头尼康SMZ745，北京中天光正科技有限公司）、流式细胞仪（型号BD FAC-SCalibur，美国Becton Dickinson公司）、小动物气体麻醉系统（型号ZH-MZJ，安徽正华生物仪器设备有限公司）、可控数显恒温手术台（分体式定制，深圳市帆与航电子科技有限公司）和整套显微手术器械（广州器化医疗设备有限公司）。

1.2   实验分组与手术方法

根据处理方法不同，将72只小鼠分为4组（每组供、受体各9只）：（1）同系对照组，以C57BL/6小鼠为供、受体建立C57BL/6→C57BL/6心脏移植模型；（2）非致敏组，以Balb/c小鼠为供体，C57BL/6小鼠为受体建立Balb/c→C57BL/6心脏移植模型；（3）预致敏组，以Balb/c小鼠为供体，C57BL/6小鼠为受体进行皮肤移植1周后行心脏移植；（4）预致敏+环孢素组，以Balb/c小鼠为供体，C57BL/6小鼠为受体进行皮肤移植1周后行心脏移植并加用环孢素，皮下注射环孢素注射液20 mg/（kg·d），从皮肤移植当日使用至移植物失功或移植物标本获取。

皮肤移植取自供体尾部，缝合于受体背部。心脏移植手术：供体正中腹部剪开，暴露下腔静脉后肝素化，剪开胸腔，暴露心脏，离断主动脉和肺动脉主干，其余血管结扎，取出供心后保存。受体小鼠腹部行正中切口，显露并游离腹主动脉和下腔静脉后阻断，供体主动脉与受体腹主动脉行端侧吻合，供体肺动脉与受体下腔静脉行端侧吻合。开放血管夹后，可见心脏立即充血后开始跳动，手术成功。所有手术操作均在SPF级小动物手术室进行，手术全程采用异氟烷诱导及维持麻醉，手术台36 ℃恒温，在显微镜下采用标准显微操作技术。

1.3   心脏移植物存活情况观察

术后每日通过直视和触诊检查心脏移植物的搏动情况，必要时可以将小鼠麻醉后切开皮肤判断心脏移植物的搏动情况，心脏完全停止搏动为移植心脏失功，记录移植心脏的存活时间。

1.4   供体特异性抗体水平检测

于皮肤移植或心脏移植前获取受体小鼠血标本，作为检测供体特异性抗体（donor specific antibody，DSA）的基础值。同系对照组、非致敏组、预致敏组和预致敏+环孢素组分别在心脏移植术后5、5、3、5 d再次获取血标本，获取方法为眼球取血，离心后获取血清。DSA检测采用流式细胞术，取受体小鼠血清，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）稀释10倍后，与供体小鼠脾细胞37 ℃下共孵育30 min。细胞洗涤后分别与异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的山羊抗小鼠IgG抗体和罗丹明标记的山羊抗小鼠IgM抗体4 ℃下共孵育1 h。细胞洗涤后用PBS重悬细胞至5×10⁶/mL，然后分别使用流式细胞术分析其平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI），了解受体小鼠循环DSA水平（IgG、IgM）水平。

1.5   心脏移植物病理学检查

同系对照组、非致敏组、预致敏组和预致敏+环孢素组分别在心脏移植术后5、5、3、5 d获取移植物标本，经4%多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋制片，行苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，光学显微镜（光镜）下观察各组移植物病理学变化。心脏移植物石蜡切片脱蜡并抗原修复后，加入一抗C4d（1:200）和CD3（1:400）抗体，过夜后加入相应的二抗，37 ℃避光孵育30 min，洗涤后加入显示剂二氨基联苯胺，苏木素复染后吹干封片，光镜下观察移植物内C4d沉积和CD3浸润情况。

1.6   统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。对于符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   心脏移植物存活时间

同系对照组小鼠心脏移植物在3个月观察期内均长期存活，非致敏组、预致敏组和预致敏+环孢素组心脏移植物存活时间分别为（7.0±0.7）d、（2.6±0.5）d和（5.0±0.7）d，非致敏组和预致敏组比较、预致敏组和预致敏+环孢素组比较，差异均有统计学意义（均为P < 0.01）。

2.2   供体特异性抗体（IgG和IgM）水平

同系对照组和非致敏组在心脏移植术后5 d DSA（IgG和IgM）水平与基础值差异无统计学意义（图 1A、B）。预致敏组在心脏移植术后3 d DSA水平较基础值显著升高[IgG-MFI为（7.7±1.9）×10³比（4.8±1.3）×10³，P < 0.05；IgM-MFI为（219±74）比（45±20），P < 0.01]（图 1C），预致敏+环孢素组在心脏移植术后5 d DSA水平较基础值也显著升高[IgG-MFI为（14.7±3.8）×10³比（6.2±1.8）×10³，P < 0.01；IgM-MFI为（175±65）比（66±17），P < 0.05]（图 1D）。

图  1  各组受体小鼠心脏移植术后DSA（IgG和IgM）水平

注：与基础值比较，^aP < 0.05，^bP < 0.01。

Figure  1.  Donor specifc antibodies (IgG and IgM) levels after heart transplantation in recipient mice of each group

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2.3   心脏移植物病理学特点

同系对照组心肌细胞结构正常，无明显炎症细胞浸润，C4d和CD3染色均无明显阳性（图 2A~C）。非致敏组在心脏移植术后5 d病理学表现为心肌细胞坏死、结构破坏，大量炎症细胞浸润在间质内，形成间质炎，C4d少量沉积，CD3细胞大量浸润（图 2D~F）。预致敏组在心脏移植术后3 d病理学表现为心肌细胞坏死、结构破坏，毛细血管内广泛血栓形成和炎症细胞浸润，形成毛细血管炎，C4d大量沉积，中等量CD3细胞浸润（图 2G~I）。预致敏+环孢素组在心脏移植术后5 d与预致敏组具有相同的病理学表现和C4d沉积，但CD3细胞浸润少于预致敏组（图 2J~L）。

图  2  各组受体小鼠心脏移植物的病理学表现（×400）

Figure  2.  Pathological manifestations of cardiac grafts in recipient mice of each group

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3.   讨论

目前普遍认为，AMR是由DSA引起的，DSA与血管内皮细胞表面的抗原结合后，通过经典途径激活补体系统，形成膜攻击复合物，损伤移植物。在补体激活过程中，补体裂解产物C4d可以共价结合在血管内皮细胞上，目前作为AMR的诊断标志物。同时，C3a、C5a等趋化因子可以招募炎症细胞浸润到移植物毛细血管内，形成毛细血管炎，进一步损伤移植物^[16-19]。在AMR中，还有很多具体的机制尚未阐明，如移植物非补体损伤的机制以及毛细血管炎对AMR损伤的机制等。AMR目前的治疗方法包括清除循环中DSA、抑制B细胞或浆细胞活性和抑制补体等^{[18, 20-21]}，但是总体治疗效果欠佳。所以，还需要更多的研究来探索AMR的发病机制和更加有效的治疗方法。

同品系的小鼠因为具有相同的基因型，移植后不发生排斥反应。在非致敏组中，心脏移植术后5 d血清DSA水平不升高，移植物病理学表现主要为心肌细胞损伤、结构破坏，大量CD3⁺T细胞在间质浸润，是典型的急性CMR模型；但是仍有少量C4d沉积，所以也存在少部分AMR成份，可能由于少量DSA产生后被移植物吸收，血清中未能检测到其水平升高，该模型目前普遍用于研究心脏移植排斥反应^{[14, 22]}。

在预致敏组中，心脏移植术后3 d，DSA水平较基础值显著升高，移植物病理学表现为心肌细胞破坏，毛细血管内广泛血栓形成和炎症细胞浸润，形成毛细血管炎，C4d大量沉积，符合急性AMR的国际诊断标准^[23]。但是，需要指出的是皮肤移植预致敏不仅会激活B细胞产生抗体，同样也会激活T细胞，导致心脏移植后快速发生强烈的排斥反应，心脏移植物存活时间仅（2.6±0.5）d，排斥反应过重。我们也检测到该模型中有中等量的CD3⁺T细胞浸润，所以该模型存在一定的CMR成份，是以急性AMR为主的混合性排斥反应。所以该模型在对AMR的研究中存在一定的局限性，比如CMR成份较多，不利于AMR的发病机制研究；排斥反应过强，治疗干预窗太短，不利于AMR治疗新方法的研究。

环孢素是目前临床广泛应用的钙调磷酸酶抑制剂类，可以有效抑制T细胞的活化和作用^[24-25]。基于此，我们从皮肤移植开始即利用环孢素抑制T细胞活化，从而抑制该模型的CMR成份。使用环孢素后心脏移植物存活时间显著延长，心脏移植术后5 d，DSA水平较基础值显著升高，且移植物内CD3⁺T细胞浸润明显减少，因此，预致敏+环孢素组是较为完善的急性AMR模型，排斥反应以AMR为主且程度适中，治疗干预窗较长，说明该模型对急性AMR的发病机制和干预研究具有更强的实用性。

综上所述，我们在利用不同品系间小鼠皮肤移植和心脏移植的基础上加用环孢素，成功建立了实用性更强的小鼠心脏移植急性AMR模型，为后续AMR的发病机制和干预研究提供基础。