Study of immunoregulatory effect of sirolimus on xenotransplantaion with arterial patch
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摘要:目的 探讨西罗莫司在异种动脉补片移植中的免疫调节作用。方法 选择野生型巴马猪至食蟹猴异种动脉补片移植手术后14 d受体猴的外周血单核细胞（POD14）为研究对象。设置二甲基亚砜（DMSO）对照组（体积比为1︰1 000）和西罗莫司实验组（终浓度为0.1 μmol/L和0.5 μmol/L），分别培养1.0 d和5.5 d，检测POD14细胞活性；设置DMSO对照组和西罗莫司实验组（终浓度为0.1 μmol/L），培养5.5 d，检测POD14细胞中T、B细胞的数量并检测细胞因子含量和信使核糖核酸（mRNA）表达水平。结果 与DMSO对照组比较，终浓度为0.1 μmol/L和0.5 μmol/L的西罗莫司处理1.0 d后，POD14细胞活性降低（ P < 0.01~0.001）；终浓度为0.1 μmol/L和0.5 μmol/L的西罗莫司处理POD14细胞5.5 d后，POD14细胞活性均明显降低（均为 P < 0.001）。与DMSO对照组比较，西罗莫司（终浓度0.1 μmol/L）降低POD14细胞中CD3+CD4+ T细胞和CD3+CD8+ T细胞的数量（ P < 0.05~0.01），而CD3-CD20+B细胞数量略有升高（ P < 0.01）。与DMSO对照组比较，西罗莫司实验组的细胞因子干扰素（IFN）-γ、白细胞介素（IL）-2、IL-4、IL-5和IL-6含量均明显降低（ P < 0.05~0.001）；西罗莫司降低细胞因子IFN-γ、肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-2、IL-4、IL-5和IL-6的mRNA表达水平（ P < 0.05~0.001）。结论 西罗莫司抑制异种动脉补片移植术后受体猴POD14细胞的增殖，主要机制是降低T细胞数量和抑制免疫排斥相关细胞因子的表达和分泌。Abstract:Objective To investigate the immunoregulatory effect of sirolimus on the xenotransplantation with arterial patch.Methods The xenotransplantation of arterial grafts was taken from the wild-type Bama pigs to cynomolgus monkeys. The peripheral blood mononuclear cells of recipient monkeys at 14 days after xenotransplantation (POD14) were selected as subjects. Dimethyl sulphoxide (DMSO) was used in the control group (volume ratio of 1:1 000) and sirolimus was administered in the sirolimus experimental group (final concentration of 0.1 μmol/L and 0.5 μmol/L). The cells were cultured for 1.0 and 5.5 d, respectively. The activity of POD14 cells was evaluated. The DMSO control and sirolimus experimental groups (final concentration of 0.1 μmol/L) were established and cultured for 5.5 d. The quantity of T and B cells in POD14 cells was counted and the expression levels of cytokines and messenger RNA (mRNA) were quantitatively measured.Results Compared with the DMSO control group, the activity of POD14 cells was significantly decreased after sirolimus treatment at a final concentration of 0.1 and 0.5 μmol/L for 1.0 d ( P < 0.01-0.001). After sirolimus treatment at a final concentration of 0.1 and 0.5 μmol/L for 5.5 d, the activity of POD14 cells was significantly decreased (both P < 0.001). Compared with the DMSO control group, the quantity of CD3+CD4+ T cells and CD3+CD8+T cells in POD14 cells was significantly reduced after sirolimus treatment at a final concentration 0.1 μmol/L ( P < 0.05-0.01), whereas the quantity of CD3-CD20+B cells was considerably elevated ( P < 0.01). Compared with DMSO control group, the levels of interferon(IFN)-γ, interleukin(IL)-2, IL-4, IL-5 and IL-6 in the sirolimus experimental group were significantly down-regulated ( P < 0.05-0.001). The expression levels of IFN-γ, tumor necrosis factor(TNF)-α, IL-2, IL-4, IL-5 and IL-6 mRNA were significantly down-regulated ( P < 0.05-0.001).Conclusions Sirolimus inhibits the proliferation of POD14 cells in the recipient monkeys after xenotransplantation with arterial patch. The underlying mechanism is that the sirolimus can reduce the quantity of T cells and suppress the expression and secretion of immune rejection-related cytokines.
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Keywords:
- Sirolimus /
- Xenograft arterial patch transplantation /
- Cell activity /
- Cell proliferation /
- T cell /
- B cell /
- Cytokine
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器官移植是器官衰竭的有效治疗手段，其成功与否受移植器官匹配情况、移植手术和术后免疫排斥反应等的制约[1]。异种器官移植为解决器官移植中供体器官严重短缺这一障碍提供了解决途径，但免疫排斥制约着异种器官移植患者的长期生存时间和生活质量。西罗莫司（雷帕霉素）是临床上广泛使用的新型大环内酯类免疫抑制剂，主要用于器官移植后的抗免疫排斥反应和自身免疫性疾病的治疗[2-3]。本研究旨在探讨西罗莫司在异种动脉补片移植模型中对免疫反应的调节作用。
1. 材料与方法
1.1 材料
野生型巴马小型猪3只，雌性，2~4个月龄，体质量5~10 kg，动脉补片移植手术供体，购自深圳市华大基因公司。食蟹猴3只，动脉补片移植手术受体，购买并饲养于广东蓝岛生物技术公司，其中受体M15001，雄性，2007年出生，9岁，体质量7.5 kg；受体M15003，雄性，2007年出生，9岁，体质量9.0 kg；受体M16003，雌性，2002年出生，14岁，体质量4.0 kg。
西罗莫司购自美国Selleck公司。复方氯胺酮注射液购自沈阳市兽药厂。Ficoll-Paque PLUS购自德国GE Healthcare公司。细胞计数试剂盒（cell counting kit，CCK）-8购自日本Dojindo实验室。植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）购自瑞士Roche公司。BD™细胞计数珠阵列NHP辅助性T细胞（helper T cell，Th）1/Th2细胞因子试剂盒、藻红蛋白（PE）-青色素（cyanine，Cy）7标记的抗人CD4抗体，PE标记的抗人CD8抗体，异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗人CD3ε抗体，别藻蓝蛋白（allophycocyanin，APC）标记的CD20均购自美国BD pharmingen公司。CellTrace TM CFSE细胞增殖试剂盒、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、100×RPMI-1640培养基、青霉素-链霉素-谷氨酰胺（penicillin-streptomycin-glutamine，P/S）、RPMI-1640培养基均购自美国Thermo Fisher Scientific公司。
1.2 野生巴马猪至食蟹猴动脉补片移植手术
复方氯胺酮麻醉野生型巴马猪，暴露一侧颈动脉，阻断血流，取颈动脉约3 cm，修剪成约2.5 cm×1.0 cm大小的梭形补片备用。食蟹猴采用氯胺酮全身麻醉，开腹暴露腹主动脉，阻断血流，沿血管方向切开2 cm左右的切口，将取材的猪颈动脉补片连续缝合于食蟹猴腹主动脉切口处，关腹缝合[4]。移植术后常规给予抗生素预防感染，未给予免疫抑制剂。
1.3 外周血单核细胞分离
根据前期研究，受体猴血清中的IgG和IgM水平在动脉补片移植术后14~42 d明显升高[4]，因此选择术后14 d，从动脉补片移植术后食蟹猴收集的外周血为研究对象，用传统分离外周血单核细胞（peripheral blood monouclear cell，PBMC）的Ficoll-Paque PLUS试剂分离得到移植术后14 d的PBMC（POD14细胞），重悬于RPMI-1640培养基（含10% FBS，1% P/S）中。用RPMI-1640培养基调整POD14细胞为106/mL，用PHA（终浓度为5 μg/mL）刺激POD14细胞。
1.4 分组
将POD14细胞分为二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）对照组（体积比为1︰1 000）和西罗莫司实验组（终浓度为0.1 μmol/L和0.5 μmol/L），37℃、5% CO2培养箱中分别培养1.0 d和5.5 d，检测POD14细胞活性，每组重复3次；将POD14细胞分为DMSO对照组（体积比为1︰1 000）和西罗莫司实验组（终浓度为0.1 μmol/L），37℃、5% CO2培养箱中培养5.5 d，检测POD14细胞中T、B细胞的数量并检测细胞因子含量和信使核糖核酸（mRNA）表达水平，每组重复3次。
1.5 细胞活性检测
每孔加入10 μL CCK-8检测试剂，混匀，37℃、5% CO2培养箱中培养4 h，测450 nm处的吸光度值。每个样品设3个重复孔。细胞活性根据如下公式计算：细胞活性（%）=（吸光度值西罗莫司实验组-吸光度值背景值）/（吸光度值DMSO对照组-吸光度值背景值）×100%。
1.6 T细胞和B细胞计数实验
收集POD14细胞，PBS清洗2次，加入PE-Cy7抗人CD4抗体，PE抗人CD8抗体，FITC抗人CD3ε抗体和APC抗人CD20抗体，4℃避光孵育30 min，FACS缓冲液清洗。流式细胞仪分析T、B细胞的数量。
1.7 细胞因子含量与mRNA表达水平检测
收集细胞上清液，按照BD™细胞计数珠阵列NHP Th1/Th2细胞因子试剂盒操作说明准备细胞因子检测样品，流式细胞仪分析细胞因子干扰素（IFN）-γ、肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-2、IL-4、IL-5、IL-6的平均荧光强度。
收集细胞沉淀，按照RNAsimple总RNA提取试剂盒操作说明提取RNA，PrimeScript TM RT Master Mix（Perfect Real Time）操作说明逆转录成互补脱氧核糖核酸（cDNA），按照SYBR® Premix Ex Taq TM试剂盒操作说明进行荧光定量聚合酶链反应（PCR）。mRNA表达水平以磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参，按照公式2-ΔΔCT计算。PCR引物序列如下：IFN-γ正向引物为5'-TCGGTAACTGACTTGAATGTCCA-3'，反向引物为5'-TCCTTTTTCGCTTCCCTGTTTT-3'；TNF-α正向引物为5'-CAGCCTCTTCTCCTTCCTGAT-3'，反向引物为5'-GCCAGAGGGCTGATTAGAGA-3'；IL-2正向引物为5'-AACTCCTGTCTTGCATTGCAC-3'，反向引物为5'-GCTCCAGTTGTAGCTGTGTTT-3'；IL-4正向引物为5'-CCAACTGCTTCCCCCTCTG-3'，反向引物为5'-TCTGTTACGGTCAACTCGGTG-3'；IL-5正向引物为5'-TGTCTGGCTGTGCCTATTTCT-3'，反向引物为5'-GTGTGCCTTGCAACCTTGAG-3'；IL-6正向引物为5'-GATGAGTACAAAAGTCCTGATCCA-3'，反向引物为5'-CTGCAGCCACTGGTTCTGT-3'；GAPDH正向引物为5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，反向引物为5'-TGGAAGATGGTGATGGGATT-3'。
1.8 统计学方法
采用Graphpad软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，比较采用独立样本t检验。 P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 西罗莫司抑制POD14细胞的增殖
西罗莫司（终浓度0.1 μmol/L和0.5 μmol/L）孵育POD14细胞1.0 d和5.5 d的细胞活性比较见图 1。结果显示，与DMSO对照组比较，终浓度为0.1 μmol/L和0.5 μmol/L的西罗莫司处理1.0 d后，POD14细胞活性降低（ P < 0.01~0.001），说明西罗莫司对POD14细胞具有一定的细胞毒性，但细胞毒性不强。终浓度为0.1 μmol/L和0.5 μmol/L的西罗莫司处理POD14细胞5.5 d后，POD14细胞活性均明显降低（均为 P < 0.001），提示西罗莫司主要抑制POD14细胞的增殖。
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图 1 西罗莫司对POD14细胞活性的影响与DMSO对照组比较，a P < 0.01，b P < 0.001Figure 1. The influence of sirolimus on the cell viability of POD14 cells2.2 西罗莫司降低T细胞和B细胞数量
采用细胞计数实验检测西罗莫司（终浓度0.1 μmol/L）对POD14细胞中T细胞和B细胞数量的影响。通过荧光标记的抗体对POD14细胞表面的分子标志物进行免疫标记，经流式细胞术分析发现，与DMSO对照组比较，西罗莫司（终浓度0.1 μmol/L）降低POD14细胞中CD3+CD4+ T细胞和CD3+CD8+ T细胞的数量（ P < 0.05~0.01），而CD3-CD20+ B细胞数量略有升高（ P < 0.01），如图 2所示。西罗莫司对T细胞亚群的影响比B细胞更为显著，说明西罗莫司（终浓度0.1 μmol/L）主要抑制T细胞介导的免疫排斥反应。
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图 2 西罗莫司对POD14细胞中T细胞和B细胞数量的影响与DMSO对照组比较，a P < 0.05，b P < 0.01Figure 2. The influence of sirolimus on the counts of T cells and B cells in POD14 cells2.3 西罗莫司对细胞因子含量和mRNA表达水平的影响
细胞计数珠阵列用于检测分泌在POD14细胞上清液中的细胞因子含量，结果显示与DMSO对照组比较，西罗莫司实验组的细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5和IL-6含量均明显降低（ P < 0.05~0.001），其中IFN-γ、IL-2和IL-6含量降低尤为明显（图 3A、B）。
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图 3 西罗莫司对POD14细胞因子的影响A图为两组POD14细胞因子平均荧光强度的流式细胞图；B图为两组POD14细胞因子含量的比较，与DMSO对照组比较，a P < 0.05，b P < 0.01，c P < 0.001；C图为两组POD14细胞因子mRNA表达水平的比较，与DMSO对照组比较，a P < 0.05，b P < 0.01，c P < 0.001Figure 3. The influence of sirolimus on cytokines in POD 14 cells细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-5和IL-6的mRNA表达水平如图 3C所示，西罗莫司均明显降低上述细胞因子的mRNA表达水平，其中细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-6 mRNA表达水平的降低尤其明显（ P < 0.05~0.001）。由此说明，西罗莫司通过调控细胞因子的分泌来调节免疫反应，西罗莫司对免疫排斥相关细胞因子的影响更为显著。
3. 讨论
异种器官移植的发展为解决供体器官短缺提供了有效的解决思路，但是异种器官移植成功的关键在于解决移植受体对供体器官的排斥（主要是物种差异）[5]。基因编辑技术为解决异种器官移植供体和受体物种差异提供了系列解决途径，如α-1, 3-半乳糖基转移酶基因敲除（α-1, 3-galactosyltransferase gene-knockout，GTKO）猪[6]、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶（cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH）基因敲除猪[7]、猪内源性逆转录病毒（porcine endogenous retrovirus，PERVs）基因敲除猪[8-9]、GTKO/CD46双基因修饰猪[10]、GTKO/CD46/NeuGcKO基因修饰猪、CMAHKO/GTKO/shTNFRI-Fc/HO-1基因修饰猪等[11]。
器官移植术后，免疫抑制剂仍是抗免疫排斥维持治疗的关键药物[12]。传统的免疫抑制剂往往面临免疫抑制效果差、感染风险高、易罹患恶性肿瘤、肾毒性、肝毒性等不良反应[13]。西罗莫司是目前临床上常用的免疫抑制剂，疗效好、不良反应少、肾毒性小，是治疗器官移植免疫排斥反应、维持移植器官（尤其是移植肾）功能的常用药物，其在异种移植中的应用和机制研究鲜有报道。猪至猴异种动脉补片是一种操作简便、易于重复的异种移植动物模型，不给予免疫抑制剂的情况下，动脉补片移植受体可保持良好生理状态，而移植的动脉补片可有效地激活受体的免疫系统，诱导体液免疫和细胞免疫排斥反应[14]。异种动脉补片为体内诱导异种免疫排斥反应和活体外筛选免疫抑制剂提供便捷的实验平台。本研究发现西罗莫司可能通过调节T、B细胞和细胞因子来发挥抗异种移植免疫排斥的作用。
前期研究发现，野生巴马猪至食蟹猴的动脉补片移植手术后，受体猴PBMC的IgG和IgM水平在术后14~42 d明显升高[4]。西罗莫司（终浓度为0.1 μmol/L和0.5 μmol/L）显著抑制POD14细胞的细胞活性，细胞毒性不明显，提示工作浓度下的西罗莫司在器官移植受体中优于传统免疫抑制剂，严重不良反应少。T细胞介导的免疫排斥反应和抗体介导的排斥反应是移植物长期生存的主要障碍。本研究中T细胞和B细胞计数分析表明，西罗莫司在体外降低CD3+CD4+ T细胞和CD3+CD8+ T细胞，提示西罗莫司主要抑制T细胞介导的免疫排斥反应。
细胞因子是免疫平衡的关键调节因子，其表达和分泌受到严格的时空和信号调控。器官移植术后细胞因子被认为是强大的调节因子和潜在的免疫应答（免疫排斥和免疫耐受）分子标志物。IL-2、IFN-γ和TNF-α是典型的Th1型细胞因子，主要参与免疫排斥反应[15-16]。据报道，IL-6参与许多免疫性疾病（如炎症和自身免疫性疾病），并成为有效的治疗靶点[17-20]，且Th17细胞和IL-6被认为参与器官移植术后免疫排斥反应[21-23]。在本研究中，西罗莫司降低细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-6的mRNA表达水平。尽管西罗莫司不同程度地降低上述细胞因子的mRNA水平，分泌到细胞上清液中的细胞因子变化与mRNA变化有差异，尤其是TNF-α，说明西罗莫司不仅影响上述细胞因子的mRNA表达水平，同时对其分泌具有一定作用。然而，细胞因子IL-2、IL-6和IFN-γ的分泌受复杂的免疫调控网络调节，提示除了直接影响细胞因子的分泌，西罗莫司可能对旁路途径中其他调节因子发挥作用。
综上所述，本研究发现西罗莫司具有通过调控T细胞和细胞因子发挥免疫抑制的潜力，同时对PBMC的细胞毒性微弱。西罗莫司可用于异种器官移植术后抗免疫排斥反应的维持治疗，本实验说明其在异种器官移植的临床应用中具有广阔的前景。
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图 1 西罗莫司对POD14细胞活性的影响
与DMSO对照组比较，a P < 0.01，b P < 0.001
Figure 1. The influence of sirolimus on the cell viability of POD14 cells
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图 2 西罗莫司对POD14细胞中T细胞和B细胞数量的影响
与DMSO对照组比较，a P < 0.05，b P < 0.01
Figure 2. The influence of sirolimus on the counts of T cells and B cells in POD14 cells
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期刊类型引用(1)
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