High-dose sirolimus protects hepatic ischemia-reperfusion injury probably through promoting cellular autophagy in aged mice
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摘要:目的 探讨高剂量西罗莫司(雷帕霉素)对老年小鼠肝脏缺血-再灌注损伤(HIRI)的保护作用及其作用机制。方法 20只C57BL/6系老年小鼠按随机数字表法随机分为4组：缺血-再灌注组(IRI组)、低剂量雷帕霉素预处理组(rpm组)、高剂量雷帕霉素预处理组(RPM组)、对照组(Sham组)，每组5只。Sham组仅开腹、关腹；其余3组建立老年小鼠70% HIRI模型，缺血时间均为60 min；rpm组和RPM组分别在术前1 h腹腔注射雷帕霉素1 mg/kg和5 mg/kg。再灌注12 h后，采用苏木素-伊红(HE)染色检测各组小鼠肝组织病理学变化，并采用Suzuki评分法进行病理学评分；比较各组小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平、血清肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-10水平以及肝组织中细胞自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ蛋白水平。结果 小鼠肝组织HE染色示Sham组为正常肝组织；IRI组和rpm组肝细胞损伤严重，炎症细胞大量浸润；RPM组可见肝窦轻度淤血，炎症细胞轻度浸润。病理学评分示RPM组为5(4~6) 分，均低于rpm组[7(5~8) 分]及IRI组[8(7~10) 分](Z=-2.554、-2.731，均为P < 0.05)。各组小鼠术后肝功能结果显示，RPM组AST[(691±207) U/L]显著低于IRI组[(2 032±575) U/L]、rpm组[(1 817±777) U/L] (t=4.90、3.13，均为P < 0.05)；RPM组ALT[(996±584) U/L]均显著低于IRI组[(2 992±992) U/L]、rpm组[(2 373±687) U/L](t=3.86、3.41，均为P < 0.05)，而IRI组和rpm组的AST、ALT比较，差异均无统计学意义(均为P > 0.05)。各组小鼠血清中的TNF-α和IL-10水平比较差异均无统计学意义(均为P > 0.05)。Western-blot法显示RPM组肝组织LC3B-Ⅱ蛋白的相对表达量明显高于Sham组、IRI组、rpm组(均为P < 0.05)。结论 高剂量雷帕霉素可能通过促进细胞自噬对老年小鼠HIRI起保护作用。Abstract:Objective To investigate the effect and mechanism of high-dose sirolimus (rapamycin) upon protecting the hepatic ischemia-reperfusion injury (HIRI) in aged mice.Methods Twenty C57BL/6 aged mice were randomly and evenly divided into the ischemia-reperfusion injury group (IRI group), low-dose rapamycin pretreatment group (rpm group), high-dose rapamycin pretreatment group (RPM group) and control group (Sham group) using the random number table method (5 mice in each group). In the Sham group, abdominal cavity was incised and sutured alone. In the other three groups, aged mouse 70% HIRI models were established. The ischemia time was 60 min. At preoperative 1 h, rapamycin at a dose of 1 mg/kg and 5 mg/kg was administered via intraperitoneal injection in the rpm and RPM groups. At 12 h post-reperfusion, hematoxylin-eosin (HE) staining was performed to observe the histological changes in the mouse liver. Suzuki grading method was adopted to evaluate the pathological score. The serum levels of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST), tumor necrosis factor (TNF)-α and interleukin (IL)-10 and the LC3B-Ⅱ protein level in the liver tissues were quantitatively measured and statistically compared among different groups.Results HE staining of the liver tissues revealed normal liver tissues in the Sham group, severe liver cellular injury accompanied with a large quantity of inflammatory cellular infiltration in the IRI and rpm groups. Mild sinusoidal congestion and slight inflammatory cellular infiltration were observed in the RPM group. The pathological score was 5 (4-6) in the RPM group, significantly lower than 7 (5-8) and 8 (7-10) in the rpm and IRI groups (Z=-2.554 and -2.731, both P < 0.05). In terms of postoperative liver function parameters, the AST level was (691±207) U/L in the RPM group, significantly lower compared with (2 032±575) U/L and (1 817±777) U/L in the IRI and rpm groups (t=4.90 and 3.13, both P < 0.05). In the RPM group, the ALT level was measured as (996±584) U/L, considerably lower than (2 992±992) U/L and (2 373±687) U/L in the IRI and rpm groups (t=3.86 and 3.41, both P < 0.05). The AST and ALT levels did not significantly differ between the IRI and rpm groups (both P > 0.05). No statistical significance was identified in the TNF-α and IL-10 levels among different groups (all P > 0.05). Western blot analysis revealed that the relative expression level of LC3B-Ⅱ protein in the liver tissue of the RPM group was significantly higher than those in the Sham, IRI and rpm groups (all P < 0.05).Conclusions Administration of high-dose rapamycin exerts a protective effect upon HIRI probably through promoting cellular autophagy in aged mice.
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自1963年Starzl教授开展首例临床肝移植至今，历经几次突破性的发展，肝移植治疗已走向成熟，被公认为治疗终末期肝病的最有效手段。肝脏缺血-再灌注损伤(hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI)是肝移植及复杂肝胆手术中不可避免的病理过程，是影响患者预后的独立危险因素。随着我国器官捐献工作的顺利开展，脑死亡器官捐献(DBD)和心脏死亡器官捐献(DCD)供体数量每年不断上升，但供体短缺仍是制约器官移植发展的重要因素之一。国内外多中心已有研究表明经过谨慎甄选，边缘供体(包括年龄 > 65周岁)来源的器官，其器官质量评估及总体预后与正常供体无明显差异[1]。随着我国人口老年化，老年供体势必成为扩大供体的主要来源之一。西罗莫司(雷帕霉素，rapamycin)是一种新型大环内酯类免疫抑制剂，临床上主要用于器官移植术后免疫抑制。国内外已有文献报道，雷帕霉素可以减轻HIRI，而在老年小鼠HIRI中研究甚少。因此，本研究通过建立老年小鼠(月龄≥6个月)70% HIRI模型，探讨高剂量雷帕霉素对老年小鼠HIRI的保护作用。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
近交系雄性C57BL/6小鼠20只，月龄6个月，体质量28~32 g。所有小鼠由南京大学-南京生物医药研究院提供。
1.1.2 主要试剂与仪器
LC3B-Ⅱ一抗购自美国CST公司；兔抗鼠二抗购自中国凯基公司；雷帕霉素购自美国Selleck公司；肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-10的酶链免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自中国伊艾博公司；倒置显微镜购自日本Nikon公司。
1.2 方法
1.2.1 老年小鼠70%HIRI模型的建立
术前禁食禁水12 h，小鼠取仰卧位，腹部正中切口进腹，暴露肝左叶及肝中叶汇合部肝蒂，用无损伤动脉夹轻轻夹闭，可观察到肝左叶及肝中叶明显缺血，颜色变浅，用血管钳临时关闭腹腔，将小鼠放置在37℃恒温加热垫上保温。
1.2.2 分组及取样方法
20只小鼠按随机数分为4组，即：对照组(Sham组)、缺血-再灌注组(IRI组)、低剂量雷帕霉素预处理组(rpm组)、高剂量雷帕霉素预处理组(RPM组)，每组5只。Sham组仅开腹、关腹，不做其他处理，余3组的缺血时间均为60 min；rpm组在术前1 h腹腔注射低剂量雷帕霉素(剂量1 mg/kg)；RPM组术前1 h腹腔注射高剂量雷帕霉素(剂量5 mg/kg)。再灌注12 h经腹主动脉取血后处死小鼠，取肝组织进行相应处理。
1.2.3 小鼠肝组织病理学检查及评分
取肝组织进行冰冻切片，采用苏木素-伊红(HE)染色。HIRI病理评分采用Suzuki评分。评分标准：肝窦淤血及肝细胞胞质空泡样改变(无为0分，少量为1分，轻度为2分，中度为3分，重度为4分)、肝细胞坏死(无为0分，单个细胞为1分， < 30%为2分， < 60%为3分， > 60%为4分)。
1.2.4 小鼠肝功能检测
各组小鼠血液样本送中山大学附属第三医院检验科检测丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)。
1.2.5 血清TNF-α和IL-10检测
各组小鼠血液样本经高速离心机分离出血清后，以ELISA法检测血清中TNF-α、IL-10水平。
1.2.6 肝组织LC3B-Ⅱ蛋白水平检测
采用Western-bolt法检测各组小鼠再灌注12 h后肝组织细胞自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ蛋白水平。Image J图形处理软件分析LC3B-Ⅱ蛋白相对表达量。
1.3 统计学方法
采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。正态分布数据以均数±标准差表示，组内比较采用单因素方差分析，组间比较用t'检验。Suzuki评分以中位数(全距)表示，比较采用Kruskal-Wallis检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 各组小鼠肝组织病理学检查结果及评分比较
小鼠肝组织HE染色示Sham组为正常肝组织；IRI组肝细胞大量凝固性坏死，大量血窦膨胀，红细胞渗出到肝窦，嗜伊红细胞增多，炎症细胞大量浸润；rpm组病理改变与IRI组相当；RPM组可见肝窦轻度淤血，炎症细胞轻度浸润，肝细胞质空泡化，病灶核固缩(图 1)。
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图 1 各组小鼠肝组织病理学图片A为Sham组，B为IRI组，C为rpm组，D为RPM组Figure 1. Histopathological pictures of liver tissues of mice in each group(HE, ×200)Suzuki评分法病理学评分，显示RPM组为5(4~6) 分，均低于rpm组[7(5~8) 分]及IRI组[8(7~10) 分](Z=-2.554、-2.731，均为P < 0.05)。
2.2 各组小鼠术后肝功能的比较
各组小鼠术后12 h肝功能结果显示，RPM组AST[(691±207) U/L]显著低于IRI组[(2 032±575) U/L]、rpm组[(1 817±777) U/L](t=4.90、3.13，均为P < 0.05)；RPM组ALT[(996±584) U/L]显著低于IRI组[(2 992±992) U/L]、rpm组[(2 373±687) U/L](t=3.86、3.41，均为P < 0.05)，而IRI组和rpm组的AST、ALT比较，差异均无统计学意义(均为P > 0.05，图 2)。
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图 2 各组小鼠术后肝功能指标的比较与IRI组比较，aP < 0.05；与rpm组比较，bP < 0.05Figure 2. Comparison of liver function indexes of mice after operation among each group2.3 各组小鼠术后血清TNF-α及IL-10的比较
术后12 h，Sham组、IRI组、rpm组、RPM组小鼠血清中的TNF-α水平分别为(20.0±2.8)、(47.4±7.6)、(42.4±10.8)、(41.2±11.4) pg/mL；IL-10水平分别为(44±13)、(131±31)、(141±26)、(124±26) pg/mL。IRI、rpm、RPM组间比较差异均无统计学意义(均为P > 0.05，图 3)。
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图 3 各组小鼠术后血清TNF-α及IL-10水平的比较Figure 3. Comparison of TNF-α and IL-10 levels in serum of mice after operation among each group2.4 各组小鼠术后肝组织LC3B-Ⅱ蛋白的比较
Western-blot法检测各组小鼠术后12 h肝组织LC3B-Ⅱ蛋白水平(图 4)，显示RPM组LC3B-Ⅱ蛋白的相对表达量明显高于Sham组、IRI组、rpm组(均为P < 0.05)。
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图 4 各组小鼠术后肝组织的LC3B-Ⅱ蛋白表达Figure 4. The expression of LC3B-Ⅱprotein in liver tissue of mice after operation in each group3. 讨论
HIRI是指肝组织缺血及缺血后血液重新恢复而导致的肝组织损伤，可分为热缺血损伤和冷缺血损伤[2]。临床上热缺血损伤常见于复杂的肝胆外科手术中需要对肝脏进行血流阻断以及失血性休克等，主要对肝实质细胞产生损害，而冷缺血损伤常见于肝移植。HIRI的病理过程起始于缺血过程中，组织器官缺氧导致三磷腺苷(ATP)供给不足，氧化磷酸化的突然中断会导致细胞ATP耗竭，糖酵解过程增加，乳酸生成增多，改变Na+、H+、Ca2+体内平衡，最终导致肝细胞严重受损[3]。同时，缺血过程可导致细胞表面蛋白、膜电位及细胞骨架的病理改变。随即在再灌注过程中，损伤的细胞释放损伤相关因子，激活肝窦内枯否细胞并释放活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)及促炎症细胞因子[4]，如TNF-α、IL-1、干扰素(IFN)-γ等。这些细胞因子持续激活枯否细胞并且富集中性粒细胞向肝窦转移，诱导局部及系统性的免疫应答，引起广泛的微血管功能障碍和改变组织屏障功能，进一步导致肝脏损伤[5]。
本研究中，我们选择月龄6个月的C57BL/6小鼠作为老年小鼠模型[6]，采用阻断肝中叶及肝左叶汇合部肝蒂，建立小鼠70%HIRI模型，处理组在HIRI动物模型建立前1 h，分别腹腔注射低剂量雷帕霉素(1 mg/kg)及高剂量雷帕霉素(5 mg/kg)。当肝脏发生HIRI时，首先受损的是肝血窦内皮细胞，内皮细胞在HIRI时，表面的黏附分子表达明显增高，使中性粒细胞的聚集增强，缩血管因子的增强影响血供，从而导致肝脏局部的继续坏死。在本研究中，IRI组病理染色显示肝内皮细胞严重塌陷，肝小叶组织结构破坏，肝细胞肿胀呈气球样变，肝细胞核皱缩，组织间大量粒细胞浸润，呈大片状坏死，说明动物HIRI模型构建成功，这与国内外相关研究结果类似[7-8]。rpm组病理改变与IRI组相当，RPM组可见肝窦轻度淤血，炎症细胞轻度浸润，肝细胞质空泡化，病灶核固缩。Sukuzi病理评分显示：RPM组的评分低于rpm组和IRI组，说明高剂量雷帕霉素对老年小鼠HIRI具有明显的保护作用，而低剂量雷帕霉素对老年小鼠HIRI保护作用不明显。本研究同时对各组小鼠的肝功能进行了检测，发现术后各组小鼠的肝功能均有不同程度的损伤，RPM组小鼠术后肝功能的损伤程度明显轻于IRI组、rpm组，这与肝组织病理学结果一致。
为了进一步研究雷帕霉素对老年小鼠HIRI的保护机制，本研究通过ELISA法测定各组小鼠术后血清TNF-α及IL-10水平，发现IRI组、rpm组、RPM组小鼠血清的TNF-α及IL-10水平比较差异无统计学意义(均为P > 0.05)，说明雷帕霉素并不是通过抑制炎症作用对小鼠HIRI起保护作用。
细胞自噬，又称为Ⅱ型细胞死亡，是真核细胞在自噬相关基因的调控下，利用溶酶体对受损的细胞器及蛋白质进行程序性降解的生物过程[9]。1962年，由比利时科学家Christian de Duve首次同过电镜观察到自噬体(autophagosome)构造，并且在1963年溶酶体国际会议上首先提出了“自噬”这种说法[10]。近年来对自噬的研究十分深入，目前认为自噬在清除细胞内代谢废物并且回收能量为细胞提供正常生理功能发挥重要作用[11-15]。自噬主要分为3个阶段：第1阶段，自噬诱导信号诱导细胞内形成不断扩张、呈非球形、扁平状双层膜的碗状结构，称之为自噬前体(phagophore)；第2阶段，不断扩张的自噬前体包裹底物形成自噬小体(autophagosome)；第3阶段，自噬小体可与胞内溶酶体结合形成自噬溶酶体(autolysosome)，并在溶酶体相关酶的作用下被降解[16]。哺乳动物细胞自噬主要有3种类型：巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侣介导自噬(chaperone-mediated autophagy)[17]。目前认为，细胞自噬通过参与胞内抗原加工并提呈主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ分子，维持T细胞的中枢耐受、调节细胞表面MHC Ⅰ类分子及调节免疫细胞的生存、增殖及效应功能[18]。本研究应用Western-bolt检测小鼠术后肝脏组织细胞自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ蛋白发现，RPM组LC3B-Ⅱ蛋白相对表达量高于rpm组及IRI组，说明高剂量雷帕霉素可能通过促进细胞自噬发挥对老年小鼠HIRI的保护作用。
综上所述，高剂量雷帕霉素对老年小鼠HIRI起保护作用，其作用机制可能是促进细胞自噬，而非抑制炎症反应。
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图 1 各组小鼠肝组织病理学图片
A为Sham组，B为IRI组，C为rpm组，D为RPM组
Figure 1. Histopathological pictures of liver tissues of mice in each group(HE, ×200)
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图 2 各组小鼠术后肝功能指标的比较
与IRI组比较，aP < 0.05；与rpm组比较，bP < 0.05
Figure 2. Comparison of liver function indexes of mice after operation among each group
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图 3 各组小鼠术后血清TNF-α及IL-10水平的比较
Figure 3. Comparison of TNF-α and IL-10 levels in serum of mice after operation among each group
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期刊类型引用(1)
1. 李子一，佟立权. 自噬在肝脏缺血再灌注损伤中的作用及研究进展. 世界华人消化杂志. 2018(13): 755-759 . 
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