大量研究提示，高水平表达Foxp3的调节性T细胞(Treg)与肝细胞癌(肝癌)的发生、复发及临床预后有密切的关系^[1-2]。Treg与效应性T细胞间的平衡决定机体对肿瘤的免疫反应，而Treg可通过直接或间接抑制作用^[3-4]，影响效应性T细胞的表达^[3-6]，从而打乱两者间的稳态，最终影响机体对肿瘤细胞及抗原的监视、提呈及杀伤作用。截止至目前为止，关于Treg与肝癌患者预后，在肝癌切除及介入治疗中的研究较多，但其与肝癌肝移植患者术后肿瘤复发关系却鲜有研究，亦无见证实两者关系的研究报道。为此，本研究分析Foxp3⁺Treg与肝癌肝移植患者术后肿瘤复发的关系，以供同行参考。

1.   材料与方法

1.1   肝癌肝移植受者的选择

选取2010年1月至2013年12月在解放军第309医院全军器官移植研究所接受肝移植的24例肝癌患者作为研究对象，以超利福尼亚大学洛杉矶分校(University of California, San Francisco，UCSF)标准为入组标准，所有患者均知情同意。其中男22例，女2例，平均年龄(53±8)岁，术前甲胎蛋白(AFP)均超过400 μg/L。所有患者术后病理证实为肝癌。以同期在该院体检中心健康人的血液标本作为对照组。

1.2   血液标本采集及指标的检测

收集肝癌肝移植受者术前及术后各阶段的血液标本，以流式细胞技术分析Treg以及T细胞各亚群的比例。

每例肝癌肝移植受者取外周血300 μl，等分为两份，分别标记为Foxp3⁺Treg组(A组)和分类组(B组)。A组加入CD4、CD25单克隆抗体各5 μl，B组加入CD3、CD8单克隆抗体5 μl，孵育16 min；接着，A、B组加磷酸盐缓冲液(PBS)134.2×g离心8 min清洗，重悬，B组等待检测。A组继续以下操作：加溶血素1 ml，低温孵育15 min，134.2×g离心8 min清洗；加预先配制(1:3)破膜液1 ml孵育60 min，134.2×g离心8 min清洗；后加低温PBS清洗1次，加1倍Buffer清洗1次；加Foxp3单克隆抗体5 μl，孵育23 min，清洗、重悬，待检测。采用流式细胞技术检测两组细胞。

1.3   随访及观察内容

24例患者术后均康复出院，术后即开始随访，截止日期为2015年5月，随访时间为20～58个月，中位随访时间33个月。根据随访期间有否肿瘤复发分为肿瘤复发组和肿瘤未复发组。

观察内容：(1)肝癌肝移植患者术后肿瘤复发情况；(2)肝癌肝移植患者的AFP的变化趋势，比较肿瘤复发组和肿瘤未复发组术前、术后不同时点AFP；(3)肝癌肝移植患者的Foxp3⁺Treg的变化趋势，比较肿瘤复发组和肿瘤未复发组术前、术后不同时点及对照组的Foxp3⁺Treg(Foxp3⁺Treg%)水平；(4)术前与术后Foxp3⁺Treg水平与AFP、CD3⁺和CD8⁺T水平的关系，采用相关分析验证。

1.4   统计学方法

采用SPSS 13.0进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。计数资料采用χ²检验。采用Spearman秩相关分析两者的相关性。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.   结果

术后随访期间，24例患者中肿瘤复发4例(肿瘤复发组)，复发时间为术后12~24个月，余20例患者未发现肿瘤复发(肿瘤未复发组)。

2.1   肝癌肝移植患者的甲胎蛋白的变化趋势

肝癌未复发组患者术前及术后1年、3年血清AFP分别为(1 199±499)μg/L、(13±10)μg/L、(11±4)μg/L，比较差异有统计学意义(P＜0.001)；与术前比较，患者术后1年及术后3年的AFP水平明显减低(均为P＜0.01)。

肝癌复发组患者的AFP变化趋势见图 1。患者术后早期维持在正常水平，肿瘤复发时AFP水平明显高于正常水平。

图  1  肝癌肝移植术后肿瘤复发患者甲胎蛋白的变化趋势

Figure  1.  The changes of AFP of patients with tumor recurrence after liver transplantation for hepatocellular carcinoma

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2.2   肝癌肝移植患者调节性T细胞的变化趋势

肝癌肝移植患者术前Foxp3⁺Treg为(1.92±0.88)%，术后(0.28±0.15)%，对照组为(0.74±0.19)%。肝癌肝移植患者Foxp3⁺Treg术后表达水平明显低于术前(P＜0.01)，而在肿瘤复发患者Foxp3⁺Treg明显高于未复发者及正常水平(P＜0.01)。

肿瘤复发患者，Foxp3⁺Treg表达再次升高，与术前表达一致，且明显高于未复发患者；经治疗后，Foxp3⁺Treg逐渐下降，且与AFP的变化一致(图 2A)。

图  2  两组患者肝移植术后Foxp3⁺调节性T细胞的表达变化

A图为肿瘤复发组，B图为肿瘤未复发组

Figure  2.  The changes of Foxp3⁺Treg of patients in two groups after liver transplantation

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对生存时间超过3年且未出现肿瘤复发的患者术后Foxp3⁺Treg表达进行分析发现，肝癌患者手术前Foxp3⁺Treg高水平表达，至术后24周，经历先下降后逐渐升高的变化趋势，而至术后48周逐渐降低，并维持在较低水平(图 2B)。

2.3   调节性T细胞与甲胎蛋白、效应性T细胞的关系

相关分析发现，肝癌肝移植患者术前和术后的Foxp3⁺Treg均与AFP呈正相关(均为P＜0.05)；相反，术前和术后的Foxp3⁺Treg与CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞水平均呈负相关关系(均为P＜0.05，表 1)。

表  1  肝癌肝移植患者的调节性T细胞与甲胎蛋白、效应性T细胞的关系

Table  1.  The relationship between Treg and AFP, effective T cell of patients after liver transplantation for hepatocellular carcinoma

指标	APF			CD3+T细胞			CD8+T细胞
	r值	P值		r值	P值		r值	P值
术前Foxp3+Treg	0.52	0.010		-0.73	< 0.001		-0.78	< 0.001
术后Foxp3+Treg	0.53	0.014		-0.52	0.015		-0.56	0.009

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2.4   肿瘤复发患者预后

4例肿瘤复发患者经过治疗后缓解2例，肿瘤无进展1例，死亡1例。

3.   讨论

AFP是诊断肝癌灵敏的肿瘤标志物，常作为肝癌术后常规监测指标。本研究观察肝癌未复发组患者的AFP变化，发现与术前比较，患者术后1年及术后3年的AFP水平明显减低(均为P＜0.01)。本研究还观察肝癌复发组患者的AFP变化趋势，发现其术后早期维持在正常水平，肿瘤复发时AFP水平明显高于正常水平。可见，AFP与肝瘤的发生、发展有着密切关系。

Foxp3⁺Treg除具有免疫调节功能外^[7]，同时具有促进肿瘤细胞生长增殖的双重功能^[8]，可抑制CD4⁺和CD8⁺效应性T细胞的活化、增殖及细胞因子的分泌^[9-11]，通过削弱机体抗肿瘤免疫力或自体对肿瘤细胞抗原的无应答，使肿瘤细胞逃避机体的免疫监视^[12-14]，促进肿瘤的生长和增殖^{[8, 15-17]}。在本研究中，与术前及正常水平相比，无肿瘤复发的肝癌肝移植患者术后Foxp3⁺Treg表达经历先降低后逐渐升高最终稳定于较低水平。与肿瘤未复发患者比较，复发患者的AFP和Foxp3⁺Treg显著升高，明显高于正常水平(均为P＜0.01)，而且在肿瘤复发患者中Foxp3⁺Treg早期异常性升高先于AFP，能更早预示肿瘤的复发。

肝癌肝移植术后患者血清AFP水平短期内可降低至正常或接近正常水平，在肿瘤复发时再次升高，同时对Foxp3⁺Treg表达与AFP、CD3⁺和CD8⁺T细胞术前、术后水平的关系进行相关分析发现，Foxp3⁺Treg与AFP变化一致，呈正相关(P＜0.01)；而与效应性T细胞(CD3⁺T细胞、CD8⁺ T细胞)表达变化相反，呈负相关(P＜0.05～0.01)，因而我们认为Foxp3⁺Treg变化直接影响机体细胞免疫功能，并可以通过联合检测AFP和Foxp3⁺Treg变化，来预测肿瘤的复发。

综上分析，Foxp3⁺Treg与肝癌肝移植术后肿瘤的复发关系密切。超UCSF标准的肝癌肝移植患者术后Foxp3⁺Treg越高，提示复发风险越大，联合检测AFP有助于及早发现肿瘤的复发。本研究属回顾性的队列研究，样本量有限，观察随访时间亦稍短，仍有待于进一步扩大样本、延长时间，并进行多中心、随机对照试验加以证实Foxp3⁺Treg对效应性T细胞的抑制作用机制。