Comparative study of effect of mechanical perfusion and simple cold preservation on DCD pancreas in pigs
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摘要:目的 对比研究机械灌注与单纯冷保存对猪心脏死亡器官捐献(DCD)供胰的影响。方法 健康猪10只, 随机分为单纯冷保存组和机械灌注组两组(每组各5只)。制备DCD猪模型, 胰腺切取后采用威斯康星大学保存液(UW液)保存。单纯冷保存组给予单纯UW液冷保存, 机械灌注组给予机械灌注保存。分别于保存1、2、3、4、6、24 h时点在胰尾部取材, 制作组织切片, 予苏木素-伊红(HE)染色。两组进行胰腺组织病理学检查, 并对病理学评分进行比较。结果 猪DCD供胰在机械灌注180 min时胰腺微血栓已被清除, 又避免了过度灌注对胰岛的损害。机械灌注组病理学评分为(4.2±0.8)分, 单纯冷保存组病理学评分为(8.4±1.1)分, 比较差异有统计学意义(P < 0.05)。结论 机械灌注可以有效清除胰腺血管内血栓。与单纯冷保存比较, 保存相同时间后, 机械灌注组更能维持胰岛的完整性。Abstract:Objective To compare the effect of mechanical perfusion and simple cold preservation on donation after cardiac death (DCD) pancreas in pigs.Methods Ten healthy pigs were randomized into simple cold preservation group and the mechanical perfusion group (5 pigs in each group). DCD model was established in pigs. The pancreas was cut and stored in University of Wisconsin solution (UW solution). The pancreas of the simple cold preservation group was preserved with simple UW solution and that of the mechanical perfusion group was preserved by mechanical perfusion. Specimen was collected from pancreatic tail at 1, 2, 3, 4, 6 and 24 h to prepare tissue section. Then, the tissue section was stained with hematoxylin-eosin (HE). Histopathological examination was conducted and pathological score of the two groups was compared.Results Microthrombus in DCD pancreas of pig was removed at 180 min of mechanical perfusion and injury to pancreas islet caused by excessive perfusion was avoided. The pathological score of the mechanical perfusion group was (4.2±0.8) and that of the simple cold preservation group was (8.4±1.1), and the difference had statistical significance (P < 0.05).Conclusions Mechanical perfusion may effectively remove thrombus in pancreatic vessels. Compared with simple cold preservation, mechanical perfusion may maintain the integrity of pancreas islet better after the preservation of the same period of time.
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近十年，我国器官移植事业发展迅速，但移植物稀缺限制了移植学科的发展。最近，我国开始发展可控性心脏死亡器官捐献(DCD)的器官移植，但这部分供体的热缺血时间相对较长，对器官功能特别是胰腺中胰岛的活性影响较大，如何提高这部分供体胰岛的活性是目前研究的重点。机械灌注在肾脏与肝脏的研究较多，而胰腺的机械灌注还处于空白阶段，本研究以杜洛克、大白、长白三元杂交猪DCD模型作为研究对象，利用机械灌注的方法，对比研究分析机械灌注后与单纯冷保存胰腺的病理学变化，旨在了解其在胰腺保存中的作用。
1. 材料与方法
1.1 实验动物和分组
本实验胰腺标本取自10只杜洛克、大白、长白三元杂交猪，雌雄不限，体重为(25±3)kg，由沈阳农业大学提供。将其随机分为单纯冷保存组和机械灌注组，每组各5只。
1.2 主要试剂及仪器
威斯康星大学保存液(University of Wisconsin solution，UW液，美国Bristol-MyersSquibb公司)。石蜡切片机(德国Leitz公司)；光学显微镜(Nikon公司)；Lifeport Kidney Transporter机械灌注仪(上海健耕医药科技有限公司)。
1.3 心脏死亡器官捐献猪模型的制备
给予实验猪速眠新Ⅱ 0.1 ml/kg于后臀深部肌内注射进行基础麻醉，丙泊酚2 mg/kg镇静、催眠，给予气管插管。丙泊酚+罗库溴铵维持麻醉。呼吸机设置：潮气量10 ml/kg，呼吸频率15次/分，最高气道峰压 < 25 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)，监测中心体温并保持在37.8～38.3℃。撤掉呼吸机，显示PaO2急剧下降，PaCO2逐渐增加，从而导致高碳酸血症和动脉pH值下降。高血流动力反射性改变导致高血压和心动过缓，最后出现心脏停搏和心室颤动。平均死亡时间是25 min。
1.4 胰腺的切取
腹部皮肤备皮，碘伏消毒，置无菌巾，取大“十”型切口入腹，上至剑突，下至耻骨联合下方，两侧至腋中线。使用腹腔脏器联合切取技术，切除膈肌、肝、肾、脾、胰，在腹主动脉插管处下方剪断腹主动脉及下腔静脉，将其全部移至无菌口袋，放置于冰盐水盆内继续降温。纵向剖开腹主动脉，紧贴左肾动脉上缘横断腹主动脉。于肝门处结扎门静脉，保证尿管管头仍放置于门静脉内，于结扎线下方横断门静脉。于十二指肠上缘横断胆管。解剖腹腔干血管，辨别脾动脉、胃左动脉、肝总动脉，结扎胃左动脉。进一步分离肝总动脉，辨别肝固有动脉、胃右动脉、胃十二指肠动脉，结扎胃右动脉，于肝固有动脉肝侧结扎。于胰腺下缘切断结扎肠系膜动脉，切断肠系膜静脉。手指置于腔静脉内，辨别肾静脉，于肾静脉上缘横断下腔静脉，紧贴肾脏将其分离出整体组织。右肾后方注意防止损伤胰十二指肠上动脉前弓，左肾后方注意防止损伤脾周血管，保护胆总管，肝固有动脉，于肝脏下缘分离肝胰，分离胰腺时避免挤压其被膜。于腹主动脉袖片分别灌注肠系膜上动脉，脾动脉及肝总动脉。观察门静脉流出液颜色，分离胰腺周围组织。分离后再次灌注观察有否血管露点。修建主动脉袖片，其应该包括肠系膜上动脉，脾动脉及肝总动脉。袖片边缘尽可能大，这样连接灌注仪时可保证其密闭性。脾切除，脾动静脉留置尽可能长，备灌注压高时血管吻合。
1.5 保存方法
两组均采用UW液保存。单纯冷保存组仅采用UW液冷保存。机械灌注组：腹主动脉袖片连接于灌注泵头，尽量保证胃十二指肠动脉，脾动脉及肠系膜上动脉得到有效灌注。灌注液温度0～4℃，灌注压力起始前60 min应 < 10 mmHg(10 mmHg=1.33 kPa，起始时灌注压力应 < 正常胰腺灌注压力，从而减少压力造成的微动脉损害)，之后根据灌注参数调整，维持于10～30 mmHg。
1.6 组织取材
分别于保存1、2、3、4、6、24 h时间点在胰尾部取材，制作组织切片，予苏木素-伊红(HE)染色。
1.7 病理检查方法
由两位病理科医师分别对组织切片进行病理学分析，两人结果一致作为最后结果，不一致则增加多一位病理科医师进行评估。在光学显微镜下观察(HE染色)下列内容：(1)胰腺血管血栓清除情况；(2)胰岛完整性。按表 1进行病理评分(0级为0分，1级为1分，以此类推)。
表 1 胰腺组织切片病理检查项目及评分要求Table 1. The pathologic examination items and grade criterion of pancreatic tissue sections分级(评分) 腺泡细胞 胰岛 炎症反应 水肿 0级(0分) 无破坏 胰岛完整，无损害 未见炎症细胞浸润 轻度 1级(1分) 轻度局部破坏＜5% 轻度损害 轻度，＜10个炎症细胞/胰岛 中度 2级(2分) 中度小叶破坏5%~20% 中度损害 中度，11～55个炎症细胞/胰岛 重度 3级(3分) 严重小叶破坏21%~40% 严重损害，胰岛不存在 重度，＞55个炎症细胞/胰岛 - 4级(4分) 广泛弥漫性破坏＞40% - - - 1.8 统计学方法
采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。所得数据用均数±标准差表示，比较采取方差分析和q检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 胰腺组织切片病理结果
详见图 1。从图 1可见在机械灌注180 min时胰腺微血栓已被清除，又避免了过度灌注对胰岛的损害。
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图 1 两组杂交猪DCD模型胰腺组织在不同保存时间的病理学变化注：保存1 h，无论单纯冷保存组(A、B图)还是机械灌注组(C、D图)，其叶间血管的红细胞开始聚集，形成血栓；保存2 h，单纯冷保存组(E、F图)变化不大，机械灌注组(G、H图)随着机械灌注的进行，叶间血管内红细胞已经清除，毛细血管内仍有红细胞存在；保存3 h，与单纯冷保存组(I、J图)比较，机械灌注组(K、L图)胰岛形态完整，而且血栓完全被清除；保存4 h，机械灌注组(O、P图)胰岛开始出现水肿、部分破坏，但单纯冷保存组(M、N图)胰岛破坏更为严重；保存24 h，单纯冷保存组(Q、R图)胰腺细胞已失去正常形态，机械灌注组(S、V图)胰岛也破坏明显Figure 1. The pathologic changes of pancreatic tissue of cross bleeding pigs of DCD model in two groups at different preservation 13:21:142.2 胰腺组织切片病理评分
保存180 min时，机械灌注组病理学评分为(4.2±0.8)分，单纯冷保存组病理学评分为(8.4±1.1)分，比较差异有统计学意义(P < 0.05)。
3. 讨论
目前，DCD已成为国际上公认的供者三大来源之一，其应用有逐年增加的趋势，并且临床效果已接连被多家国际权威医学机构所肯定[1-4]。但是，DCD器官由于热缺血时间较长，在移植术后发生移植物功能障碍和原发性无功能的风险较高，因此器官的移植前保存和修复已成为DCD器官捐献工作中的重中之重。
对于胰腺的冷保存，已有相关研究表明，其最佳冷保存温度为4℃。然而，胰腺在低温条件下细胞氧化磷酸化作用降低，细胞无氧酵解生成的能量不能满足组织代谢所需[5]，结果储存的能量物质很快被消耗。相对于其他器官，胰腺的有效保存时间更短。为了解决上述问题，学者们提出了许多建议，目前最被接受的是Kuroda等[6]提出应用两层法体外保存胰腺, 此方法为胰腺组织提供了丰富的氧气和三磷腺苷(ATP)，保持细胞的活性和维持细胞膜的完整性[7]，防止组织坏死和细胞肿胀，延长了冷缺血的可耐受时间；较单纯应用UW液该法可以明显提高胰岛的纯化数量和活力[8]，甚至使一些冷缺血时间长于胰岛移植要求的所谓“边缘”胰腺供体也可用于移植[9-10]，但由于其工艺繁琐，限制了两层法体外保存的临床应用范围。
基于上述问题，我们采用机械灌注的方法来实现DCD胰腺的移植前保存和修复，并取得了预期效果[11]。有研究表明器官保存时由于微环境改变和炎症因子的介入，使得分离后的胰岛与血液接触后引发瞬时血液介导炎症反应，导致移植物凋亡和早期失功能[12-16]。对于DCD供器官来说，由于热缺血时间较长，上述表现更尤为突出[17]。本文研究的病理结果正是验证了机械灌注对DCD胰腺可起到清除微血栓，改变微环境的作用，为后续提高胰岛质量等研究提供了实验学基础。
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图 1 两组杂交猪DCD模型胰腺组织在不同保存时间的病理学变化
注：保存1 h，无论单纯冷保存组(A、B图)还是机械灌注组(C、D图)，其叶间血管的红细胞开始聚集，形成血栓；保存2 h，单纯冷保存组(E、F图)变化不大，机械灌注组(G、H图)随着机械灌注的进行，叶间血管内红细胞已经清除，毛细血管内仍有红细胞存在；保存3 h，与单纯冷保存组(I、J图)比较，机械灌注组(K、L图)胰岛形态完整，而且血栓完全被清除；保存4 h，机械灌注组(O、P图)胰岛开始出现水肿、部分破坏，但单纯冷保存组(M、N图)胰岛破坏更为严重；保存24 h，单纯冷保存组(Q、R图)胰腺细胞已失去正常形态，机械灌注组(S、V图)胰岛也破坏明显
Figure 1. The pathologic changes of pancreatic tissue of cross bleeding pigs of DCD model in two groups at different preservation 13:21:14
表 1 胰腺组织切片病理检查项目及评分要求
Table 1 The pathologic examination items and grade criterion of pancreatic tissue sections
分级(评分) 腺泡细胞 胰岛 炎症反应 水肿 0级(0分) 无破坏 胰岛完整，无损害 未见炎症细胞浸润 轻度 1级(1分) 轻度局部破坏＜5% 轻度损害 轻度，＜10个炎症细胞/胰岛 中度 2级(2分) 中度小叶破坏5%~20% 中度损害 中度，11～55个炎症细胞/胰岛 重度 3级(3分) 严重小叶破坏21%~40% 严重损害，胰岛不存在 重度，＞55个炎症细胞/胰岛 - 4级(4分) 广泛弥漫性破坏＞40% - - - 
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[1] Immer FF. Organ donation after circulatory death in Switzerland:slow but constant progress[J]. Swiss Med Wkly, 2015, 145:w14062. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25587710
[2] Rana A, Gruessner A, Agopian VG, et al. Survival benefit of solid-organ transplant in the United States[J]. JAMA Surg, 2015, 150(3):252-259. DOI: 10.1001/jamasurg.2014.2038
[3] Brant SM, Cobert ML, West LM, et al. Characterizing cardiac donation after circulatory death:implications for perfusion preservation[J]. Ann Thorac Surg, 2014, 98(6):2107-2114. DOI: 10.1016/j.athoracsur.2014.05.091
[4] Salmeron-Rodriguez MD, Navarro-Cabello MD, Agüera-Morales ML, et al. Short-term evolution of renal transplant with grafts from donation after cardiac death:Type Ⅲ Maastricht category[J]. Transplant Proc, 2015, 47(1):23-26. DOI: 10.1016/j.transproceed.2014.11.012
[5] Kwon AH, Inui H, Yoshida K, et al. Pancreatic islet preservation at temperatures just above the freezing point[J]. Transplant Proc, 2003, 35(1):480-482. DOI: 10.1016/S0041-1345(02)03843-5
[6] Kuroda Y, Fujino Y, Kawamura T, et al. Mechanism of oxygenation of pancreas during preservation by a two-layer (Euro-Collins' solution/perfluorochemical) cold-storage method[J]. Transplantation, 1990, 49(4):694-696. DOI: 10.1097/00007890-199004000-00008
[7] Linn T, Schmitz J, Hauck-Schmalenberger I, et al. Ischaemia is linked to inflammation and induction of angiogenesis in pancreatic islets[J]. Clin Exp Immunol, 2006, 144(2):179-187. DOI: 10.1111/cei.2006.144.issue-2
[8] Ramachandran S, Desai NM, Goers TA, et al. Improved islet yields from pancreas preserved in perflurocarbon is via inhibition of apoptosis mediated by mitochondrial pathway[J]. Am J Transplant, 2006, 6(7):1696-1703. DOI: 10.1111/ajt.2006.6.issue-7
[9] Tanaka T, Suzuki Y, Tanioka Y, et al. Possibility of islet transplantation from a nonheartbeating donor pancreas resuscitated by the two-layer method[J]. Transplantation, 2005, 80(6):738-742. DOI: 10.1097/01.TP.0000174136.70282.5A
[10] Weegman BP, Suszynski TM, Scott WE 3rd, et al. Temperature profiles of different cooling methods in porcine pancreas procurement[J]. Xenotransplantation, 2014, 21(6):574-581. DOI: 10.1111/xen.2014.21.issue-6
[11] Huang J, Millis JM, Mao Y, et al. A pilot programme of organ donation after cardiac death in China[J]. Lancet, 2012, 379(9818):862-865. DOI: 10.1016/S0140-6736(11)61086-6
[12] Demos DS, Iyengar A, Bryner BS, et al. Successful porcine renal transplantation after 60 minutes of donor warm ischemia:extracorporeal perfusion and thrombolytics[J].ASAIO J, 2015[Epub ahead of print]. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25851315
[13] Seal JB, Bohorquez H, Reichman T, et al. Thrombolytic protocol minimizes ischemic-type biliary complications in liver transplantation from donation after circulatory death donors[J]. Liver Transpl, 2015, 21(3):321-328. DOI: 10.1002/lt.v21.3
[14] Emamaullee JA, Shapiro AM. Interventional strategies to prevent beta-cell apoptosis in islet transplantation[J]. Diabetes, 2006, 55(7):1907-1914. DOI: 10.2337/db05-1254
[15] Matsumoto S, Okitsu T, Iwanaga Y, et al. Successful islet transplantation from nonheartbeating donor pancreata using modified Ricordi islet isolation method[J]. Transplantation, 2006, 82(4):460-465. DOI: 10.1097/01.tp.0000231710.37981.64
[16] Pileggi A, Cobianchi L, Inverardi L, et al. Overcoming the challenges now limiting islet transplantation:a sequential, integrated approach[J]. Ann N Y Acad Sci, 2006, 1079:383-398. DOI: 10.1196/annals.1375.059
[17] Siskind E, Akerman M, Maloney C, et al. Pancreas transplantation from donors after cardiac death:an update of the UNOS database[J]. Pancreas, 2014, 43(4):544-547. DOI: 10.1097/MPA.0000000000000084
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